线粒体自噬之线粒体溶酶体荧光共定位检测

科研线粒体自噬线粒体自噬溶酶体荧光共定位在线粒体自噬检测中，荧光共定位实验是必不可少且非常锦上添花的。表现在直观可视，添加伪彩色后，花红柳绿非常好看，对编辑审稿人也是一种感官吸引。对有厚度的组织来说，拍Z轴是很普遍的。但在细胞的荧光共定位实验中，什么时候需要拍Z轴呢？ [向右R][向右R][向右R]我们都知道虽然贴壁细胞看似单单一层贴着，似乎薄成一片，但实际上一般贴壁细胞的厚度也在2-5um之间，如果从超微结构来看，也是三维立体XYZ俱全。 [向右R][向右R][向右R]线粒体自噬的荧光检测中，一般来说共聚焦显微镜是必不可少的。在共聚焦显微镜中，针孔(pinhole)与探测针孔(detection pinhole)共轭(共焦)，用于提高共聚焦显微镜的层析能力，可滤除焦点以外的荧光信号。在样品荧光信号不错的情况下，增大针孔尺寸，空间分辨率下降，所以我们在非Z轴拍摄时常设置为1AU，如果大家仔细看参数，会发现1AU的光切厚度其实大概在0.3-0.5um左右，这意味着虽然在拍摄时收集到了最大荧光切面的荧光，但依然会损失其他光切面的荧光。而过于调高Pinhole虽然Z轴的光学切片厚度增大，可以捕获更多光子，信号荧光强度也更强，但又会损失空间分辨率分辨率。 [向右R][向右R][向右R]而在双荧光标记以多荧光标记中，又会遇到另一个问题，即两个荧光信号并不一定就完全在同样的光切面，所以在共定位拍摄时尤其是线粒体自噬这种常表现为局部共定位的荧光信号，可以拍Z轴，捕捉不同的光切面，经3D重构后最大限度保留不同层面不同荧光通道的荧光信号。我们以上图为例，在线粒体和溶酶体的共定位实验中，线粒体和溶酶体可能在不同的层切面有局部共定位，如果不拍Z，可能会损失某些光切面的共定位信号。