想要深入研究miRNA，实验者必须掌握的核心要点就是如何精准且特异性地检测和定量miRNA。我们都知道，miRNA由于自身短小无法像普通mRNA一样直接使用Oligo(dT)引物或随机引物进行逆转录，常规的逆转录引物难以与其实现理想的碱基互补配对，这就给miRNA 逆转录带来了极大的困难。为克服这一障碍，对miRNA分子进行加长改造成为实现有效逆转录的必要步骤。当前，主要存在两种较为成熟的技术方法，即Poly (A)加尾法逆转录和茎环法逆转录。

那么，这两种方法如何选择才能更高效的达到检测靶基因的目的呢？下面一起深入了解一下两种方法的原理、技术要点以及如何选择适合自己实验需求的方法吧！

一、miRNA加尾法逆转录

该方法的原理是通过Poly(A)聚合酶在miRNA的3'端添加Poly(A)尾，延长后的序列可与Oligo(dT)引物结合，再进行逆转录。

图1. miRNA加尾法原理及过程。

加尾法逆转录效率的关键在于两点，一是Poly (A)聚合酶的活性，当Poly (A)聚合酶具有较高活性时，它能够在较短时间内为miRNA添加足够长度的Poly (A)尾巴。这一延长的Poly (A)尾巴，使得miRNA分子可以与Oligo (dT)引物高效结合，为后续的逆转录反应提供基础。研究者可以选择Thermo、Takara、BIOG等品牌的Poly (A)聚合酶，经过工程优化，相比普通酶具有更高的加尾效率，能够高效快速地给miRNA加上腺苷酸尾巴并提高miRNA的稳定性。二是Oligo (dT)引物的设计，单纯的Oligo (dT)引物在与miRNA结合时，容易出现碱基错配现象，从而导致逆转录效率降低。为解决这一问题，在设计Oligo (dT)引物时添加锚定碱基，可显著增强其与miRNA结合的特异性和高效性，进而提升逆转录反应的整体效率。

二、miRNA茎环法逆转录

miRNA茎环法逆转录的原理是利用一种稳定的双链结构--茎环(stem-loop)结构作为逆转录引物，与miRNA中目标序列互补结合，形成DNA/RNA复合体，随后利用逆转录酶将RNA序列逆转录为cDNA，从而实现miRNA表达的测量和分析等功能，其过程如下：

图2. miRNA茎环法原理及过程。

茎环法逆转录的关键在于茎环结构的设计，对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的逆转录引物。理想的茎环结构需要具备与miRNA的3’端特异性、高效结合的能力，同时，在逆转录过程中，该茎环结构还应能够顺利地进行折叠和打开，以确保逆转录反应的顺利进行。

三、加尾法逆转录or茎环法逆转录？

根据上述所介绍的两种逆转录方法的原理及技术要点，研究者可结合自己的实验需求来进行选择，这边给大家提供一种高效且经济的选择思路：

加尾法是对所有miRNA无差别化加上polyA尾巴来延长cDNA长度，一次逆转录可获得多个miRNA逆转录产物，属于高通量逆转录，因此，对于需要研究多个（3个以上）miRNA的科研人员而言，Poly (A)加尾法逆转录试剂更为适用。

茎环法由于其特异性非常强，一次逆转录只可获得一种miRNA逆转录产物，且在检测灵敏度上要高出加尾法10倍以上，因此适用于少量目标miRNA的精确定量检测或者是对实验结果精准度要求较高的实验。

miRNA逆转录实验成功后，后续qPCR通常能收获理想结果，但有两点关键注意事项需重点关注：

首先，miRNA逆转录试剂盒与qPCR试剂盒需配套使用，科研人员挑选试剂时，建议优先选用同一厂商生产的成套产品。这是由于逆转录引物上会预设PCR引物的结合序列，若混搭不同厂家的试剂，可能导致PCR引物无法与逆转录产物特异性结合，最终造成实验失败。

其次，对于刚接触miRNA研究的科研人员而言，上游引物设计难度较大。不仅需要投入大量时间和精力，实验结果也未必理想。因此，建议选择百代生物这类会附赠上游引物的逆转录试剂厂家，既能有效降低实验操作难度，也能进一步提升实验成功率。