荧光原位杂交（FISH）技术是基因定位与定性研究的利器，但其繁琐的步骤常让研究者，尤其是新手望而生畏。其实，只要选对工具，实验可以变得简单高效---荧光标记核酸探针正是这样一把“钥匙”。它不仅省去了生物素或地高辛系统中复杂的免疫酶促反应，更凭借独一无二的多重检测能力，让研究者能通过荧光显微镜直接观察多个靶点，实现“一实验，多结果”，是进行高效多重FISH分析的理想选择。
本篇文章将聚焦于荧光标记核酸探针的合成与FISH实验中的关键环节，帮助大家掌握实验要点，提高FISH实验的成功率！
一、荧光标记核酸探针合成指南
FISH实验中，荧光标记核酸探针的制备是整个实验成功的基石，其按照核酸类型主要分为DNA探针和RNA探针。
1.荧光标记DNA探针
荧光标记的DNA探针合成方法有多种，如缺口平移法、随机引物法和PCR法，其核心思想都是将带有荧光标记的脱氧核苷酸（如Cy3-dUTP、Fluorescein-dUTP）掺入到新合成的DNA链中。这些合成方法看着很常见，但市面上却鲜少有这样的DNA探针合成试剂盒，主要原因是这些方法所合成出来的荧光标记DNA探针产量并不高，且在杂交效率和检测灵敏度方面表现不足。其次，荧光标记的脱氧核苷酸种类较少且成本昂贵，也限制了研究者的选择空间。相比之下，完全可以选择更具性价比的地高辛标记核苷酸来制备DNA探针，再结合酶促反应，通常可获得比荧光标记DNA探针更高的检测灵敏度，常用的地高辛标记试剂盒有罗氏、百代生物等，都是比较不错的选择。如果实验确实需要使用荧光标记探针，则更推荐选用荧光标记的RNA探针，与DNA探针相比，RNA探针拥有更高的杂交效率与检测灵敏度。
2.荧光标记RNA探针
荧光标记RNA探针是荧光原位杂交FISH实验中使用最为广泛的探针类型。对于荧光标记RNA探针的合成通常通过体外转录实现，其核心是将荧光标记的核糖核苷酸（如Cy3-UTP、Cy5-UTP、Fluorescein-UTP）掺入到RNA转录本中。市面上这类试剂盒品牌像赛默飞、罗氏、百代生物等性能都不错，但一般进口试剂价格比较高，研究者可以根据实验经费和实验需求自行选择。如果较为关注探针产量，可选择使用经基因工程改造后的T7 RNA聚合酶来制备探针的试剂盒，单次反应产量可高出普通T7 RNA聚合酶百分之50以上，百代生物就是用的这样酶，单次制备的RNA探针量可达5-9 ug，这点显著优于其他品牌试剂盒（单次制备量为2-6ug）。此外，百代生物的探针合成试剂盒一直以来都比较注重反应体系的优化，体系优化的越好，其可掺入的荧光标记核苷酸就越多，对于提升后续FISH实验结果的检测灵敏度非常有帮助。
二.荧光原位杂交FISH实验指南
荧光原位杂交FISH实验，除了以上所阐述的探针十分重要以外，在实验中研究者还需要关注以下几方面：
1.样本制备与固定
样本质量是FISH实验成功的重要前提，其决定了后续所有步骤的上限。研究者要尽量使用新鲜的细胞或组织样本。对于RNA FISH，操作需更加迅速并使用RNase-free的试剂和耗材，以防止降解RNA。此外，选择适当的固定剂（如多聚甲醛）并优化固定时间。固定不足会导致核酸降解和形态破坏；固定过度会降低通透效率，掩盖靶点。关键是要保持细胞形态的同时，最大限度地暴露靶核酸。
2.通透
通透步骤是连接样本固定与杂交的桥梁，是确保原位杂交实验成功的关键环节之一，其目的是让探针能够进入细胞核与靶DNA/RNA结合。通透不足，探针无法有效进入细胞/细胞核，靶序列仍被蛋白质包裹；通透过度，则会破坏细胞形态和靶位点结构。想要做好这步，通透液的成分较为关键，研究者可自行查找相关文献进行配置，但实验成功率和可重复率往往难以保证，最好还是使用专业的荧光原位杂交试剂盒。要关注的是，不同厂家试剂盒内的通透液配方和技术具有一定差异，如BIOG的通透工作液中特别添加了通透因子，不仅能帮助在细胞膜上进行高效打孔，使探针更容易进入，而且还可有效避免对胞浆胞核造成损坏，大大提高了原位杂交实验的成功率。
3.杂交
杂交是整个原位杂交实验中的核心步骤，能决定杂交结果好坏的最关键成分便是杂交液。杂交液为探针与靶序列的结合提供环境。诸如Roche、BIOG的杂交液都比较不错，不仅能促进特异性杂交，充分封闭组织细胞中探针的非特异结合位点（阻断非特异性结合），还特别添加了稳定剂成分，能将探针分子“困”在局部区域，有效增加探针的相对浓度，从而大大加速杂交反应速率，更能使杂交体保持稳定，从而提高实验成功率。
4.洗涤
洗涤步骤是决定信噪比（特异性）的最后一道关卡。研究者可重点关注盐浓度和温度。洗涤液中的盐浓度（SSC浓度）影响杂交体的稳定性，从高盐浓度到低盐浓度的梯度洗涤是常见策略。温度方面，提高洗涤温度能有效洗脱非特异性结合或部分错配的探针，从而降低背景，但温度过高也会洗掉特异性信号，需要优化。
5.设置对照
在FISH实验中，设置对照是客观解读结果、排除假象的关键环节。阳性对照主要用于来验证整个实验流程的操作准确性，阴性对照主要用于确认观察到的信号是特异的，而非背景或非特异性结合造成的。只有在阳性对照有强信号、阴性对照无信号的前提下，目标样本的FISH结果才是可靠、可解读的。忽略对照设置，得到的任何“阳性”或“阴性”结果都可能是误导性的。
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