生物素标记探针由于具有强大的信号放大能力、灵活多样的检测方法、良好的稳定性以及成本效益的优势，在各类分子杂交实验中应用相当广泛，其所依赖的生物素-链霉亲和素系统是分子生物学中最经典、最成熟的检测系统之一。

本文拟对生物素标记探针的合成及其在各种分子杂交实验中的检测方法这两方面来为大家归纳总结关键实验要点。

一、生物素标记探针的制备

生物素标记的探针按照核酸类型可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。其中生物素标记的寡核苷酸探针一般需依靠生物合成公司以化学合成的方法来制备。能够由研究者自行制备的生物素标记探针主要是DNA探针和RNA探针。

生物素标记DNA探针的制备主要采用PCR法，即在PCR反应体系中，使用一定比例的Biotin-11-dUTP与普通dNTP的混合物，即可扩增出生物素标记的双链DNA探针。其优势是十分稳定，易于保存，但在杂交效率和灵敏度上不及RNA探针，RNA探针的灵敏度可高出DNA探针10倍以上，因此，更多的研究者会更偏向于使用生物素标记的RNA探针。

生物素标记RNA探针目前主要通过体外转录法来制备。研究者可优选使用T7 RNA聚合酶的体外转录试剂盒，该酶在转录效率和产量上要优于SP6 RNA聚合酶，类似的试剂盒品牌有Thermo Fisher、Roche、BIOG等。但不同厂家的T7 RNA聚合酶合成探针的产量有所差异，如使用Thermo Fisher的T7 RNA聚合酶单次反应可合成2-6ug探针，使用BIOG T7 RNA聚合酶单次反应可合成6-10ug探针，可能是BIOG使用的是经基因工程改造后的T7 RNA聚合酶，因此具备更高的酶活性，对产量有所提升。研究者可根据探针产量需求选择合适的试剂盒。另外，还有一点需要特别注意的是试剂盒的反应体系能否支持掺入更多比例的生物素标记，这点容易被忽略，但却十分重要，生物素标记核苷酸掺入的比例越高，RNA探针活性就越高，检测灵敏度也就随之越高。但跟DNA探针合成不同的是，在RNA探针合成中使用Biotin-16-UTP的效果将优于Biotin-11-UTP。Biotin-16-UTP的长链设计优化了生物素暴露，减少空间位阻，能够使RNA聚合酶更易掺入，生成高密度标记的RNA探针；同时稳定性也比Biotin-11-UTP更强，可减少实验过程中的标记脱落风险。研究者在选择试剂盒时可关注这一点哦，下面是我们实验室曾做过的关于生物素标记RNA探针灵敏度的检测实验，结果显示以Biotin-16-UTP标记的RNA探针，最低可检测低到0.16ng的目标产物。

图1.GAPDH PCR产物5倍系列稀释，BIOG生物素标记RNA探针试剂盒合成的Biotin-GAPDH RNA斑点杂交检测实验结果。

二、生物素标记探针的检测

生物素标记探针的检测核心是依赖于生物素与（链霉）亲和素之间超高强度的特异性结合。根据不同的核酸杂交方式，生物素标记探针提供了多种检测终点，以适应不同的实验需求：

1.各类膜杂交实验

在譬如Southern Blot（DNA印迹）、Northern Blot（RNA印迹）、斑点杂交等各类膜杂交实验中，最常使用的检测生物素标记的方法为化学发光法，在杂交后使用HRP标记的链霉亲和素与样本进行孵育，使之与生物素标记探针结合，再利用ECL化学发光检测试剂进行检测即可。如果目标分子丰度极低，建议选择配置有超敏飞克极别化学发光液的生物素标记核酸检测试剂盒，像Roche、BIOG等，其检测灵敏度较普通ECL配方要高出10倍以上，即使是极微量的目标分子也可检出。

2.原位杂交实验

在普通（显色）原位杂交实验中，生物素标记探针通过在杂交后孵育AKP或HRP标记的亲和素，即可通过NBT/BCIP（蓝紫色沉淀）或DAB（棕色）检测方式对其进行显色。

除了显色原位杂交，生物素标记探针还常常用于荧光原位杂交（FISH）实验，通过孵育荧光素标记的亲和素（如Cy3-Avidin、FITC-Avidin、DyLight 488-Avidin、DyLight 594-Avidin等）即可采用荧光检测法观察实验结果，即根据携带的荧光基团，在受激发光后发出特定波长的荧光，直接通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等仪器检测荧光信号分布位置即可。该种检测方式具有级联效应，可将杂交信号进行二次放大，提高检测的灵敏度，在某些需要信号放大的困难靶点检测实验中尤其适用。另外，由于亲和素标记的荧光素种类比能直接标记到探针上的荧光素种类要更多，这使得生物素标记探针可以用于多色FISH实验，研究者可拥有更加灵活的选择空间，Fish实验整体的灵敏度也能得到提升。目前，市场上做该类型Fish实验的试剂盒品牌只在极少数，研究者可优先选择像百代生物这样的龙头企业品牌，产品性能更有保证，并且使用该试剂盒，研究者可省去繁琐的预杂交步骤，实验流程更简便的同时实验效率也能得到显著提升。