在肿瘤诊疗、靶向递送等领域，靶向多肽探针的核心价值在于 “精准识别特定生物靶标”，而高效筛选是获取这类分子的关键前提。目前主流筛选方法已从传统的 “随机富集” 发展到 “理性设计 + 高通量验证” 的多元体系，不同方法在筛选通量、靶点适配性、活性保障上各有侧重，需根据靶标类型（如可溶性蛋白、膜蛋白、胞内靶点）与研发需求选择。本文将系统拆解 6 类核心筛选方法，解析其原理、优势及适用场景。

一、体外展示筛选技术：从 “海量库” 中淘选阳性序列

体外展示技术通过构建包含海量多肽序列的文库，利用 “表型 - 基因型关联” 实现高效筛选，是目前应用最广的方法，核心包括噬菌体展示、mRNA 展示与核糖体展示。

1. 噬菌体展示技术：胞外靶点的 “经典筛选工具”

核心原理：将多肽编码基因插入噬菌体（如 M13、T4）外壳蛋白基因（pⅢ/pⅧ），使多肽与外壳蛋白融合展示在噬菌体表面；通过 “吸附（多肽结合靶标）- 洗脱（去除非特异性克隆）- 扩增（感染细菌富集）” 的 3-5 轮循环，筛选出高特异性多肽。优势：

依赖大肠杆菌体内表达，多肽可形成正确二硫键（如含 2-3 对二硫键的抗菌肽），构象与天然状态一致性达 80% 以上，活性有保障；

操作简单，无需复杂体外系统，实验室可独立完成，成本仅为 mRNA 展示的 1/3；

可直接用活细胞筛选膜蛋白靶点（如 GPCR），避免纯化过程中靶标构象改变导致的假阴性。适用场景：胞外可溶性蛋白（如 HER2、EGFR）、细胞膜表面受体（如 PD-1、CTLA-4）的多肽筛选，尤其适合对构象要求高的功能肽（如中和肽、靶向肽）。

2. mRNA 展示技术：高难度靶点的 “高通量解决方案”

核心原理：纯体外完成 “转录 - 翻译 - 筛选”—— 体外转录多肽 mRNA，在 mRNA 3' 端偶联嘌呤霉素（与多肽 C 端形成共价键）；在无细胞翻译系统（如兔网织红细胞裂解液）中形成 “mRNA - 核糖体 - 多肽” 三元复合物；通过靶标捕获复合物后，回收 mRNA 反转录为 cDNA 测序，获得多肽序列。优势：

库容极高（10¹²-10¹³），是噬菌体展示的 1000 倍，可覆盖低丰度高活性多肽，筛选成功率超 90%；

可灵活引入非天然氨基酸（如 D - 氨基酸、磷酸化氨基酸），显著提升多肽稳定性（抗酶解半衰期延长 5-10 倍）与特异性；

纯体外环境可模拟胞内条件（如添加胞内缓冲液），适配胞内靶点（如核转录因子 p53、胞内酶）。适用场景：胞内靶点、弱免疫原性靶点（如小分子化合物受体）、需非天然氨基酸修饰的多肽筛选，尤其适合临床级长效多肽药物研发。

3. 核糖体展示技术：无载体依赖的 “灵活筛选系统”

核心原理：通过设计终止密码子缺失的 mRNA，使翻译形成的 “mRNA - 核糖体 - 多肽” 三元复合物稳定存在于体外系统；直接用靶标捕获复合物，回收 mRNA 后反转录测序。优势：无需噬菌体 / 质粒载体，可快速构建文库（1-2 天）；无细胞毒性限制，可筛选对细菌有毒性的多肽（如溶菌肽）。劣势：三元复合物稳定性差（4℃仅稳定数小时），需快速完成筛选；库容低于 mRNA 展示（约 10¹⁰）。适用场景：快速验证短肽序列（5-10 个氨基酸）、有毒性多肽的初步筛选。

二、细胞水平筛选技术：模拟生理环境的 “真实靶向验证”

体外展示技术筛选的多肽可能因体内环境（如酶解、细胞间质阻隔）失效，细胞水平筛选直接在活细胞 / 类器官模型中操作，更贴近生理状态，核心包括细胞亲和筛选与功能导向筛选。

1. 细胞亲和筛选：膜蛋白靶点的 “精准捕获”

核心原理：将多肽文库（如荧光标记肽库、噬菌体肽库）与表达靶标的活细胞共孵育，通过流式细胞术（FACS）或磁珠分选，收集结合多肽的细胞，再通过质谱或测序鉴定多肽序列。关键优化：

采用 “阴性筛选 + 阳性筛选” 两步法：先与不含靶标的细胞孵育，去除非特异性结合多肽；再与靶标阳性细胞孵育，提升筛选特异性；

对悬浮细胞（如免疫细胞），可通过荧光强度分选高亲和力多肽（荧光信号强的细胞结合的多肽亲和力更高）。适用场景：肿瘤细胞表面抗原（如 PSMA、CD19）、免疫细胞受体（如 CD47、TIM-3）的多肽筛选，尤其适合无法纯化的膜蛋白靶点。

2. 功能导向筛选：基于活性的 “反向筛选”

核心原理：不直接检测多肽与靶标的结合，而是通过监测多肽介导的生物学功能（如细胞增殖抑制、信号通路激活）筛选阳性序列，例如：

针对肿瘤细胞凋亡相关靶点（如 Bcl-2），筛选能诱导肿瘤细胞凋亡的多肽；

针对免疫检查点（如 PD-L1），筛选能恢复 T 细胞杀伤活性的多肽。优势：直接筛选有功能活性的多肽，避免 “结合活性强但功能弱” 的假阳性序列，后续开发成功率高。劣势：通量较低（一次筛选仅能检测数百个多肽），适合对初筛阳性序列的功能验证。适用场景：功能依赖性靶点（如酶、信号通路受体）的多肽筛选，或临床级功能肽（如凋亡诱导肽、免疫激活肽）的验证。

三、计算生物学辅助筛选：从 “结构” 到 “序列” 的理性设计

借助 AI 与分子模拟技术，可基于靶标蛋白结构直接设计多肽序列，大幅缩短筛选周期，减少盲目性，核心包括结构对接筛选与序列进化分析。

1. 分子对接与动力学模拟：精准预测结合模式

核心原理：通过 AutoDock Vina、Schrödinger 等软件，将虚拟多肽库（通常含 10⁵-10⁶条序列）与靶标蛋白的活性口袋进行对接，计算结合能（如氢键、疏水作用、静电作用），优先选择结合能低（<-8kcal/mol）、关键氨基酸（如 Arg、Tyr）与靶点残基匹配的序列。关键步骤：

预处理靶标蛋白：去除结晶水、加 Gasteiger 电荷，定义活性口袋（如以已知配体结合位点为中心的 10Å 范围）；

虚拟突变优化：对初筛序列进行单点突变（如将 Ala 替换为 Lys），通过分子动力学模拟（100ns 以上）验证突变后结合稳定性的变化，进一步提升亲和力。优势：无需构建实体文库，周期短（1-2 周），可定向设计高亲和力多肽（KD 值可达 nM-pM 级）。适用场景：已知三维结构的靶标蛋白（如通过 X 射线晶体衍射、冷冻电镜解析的结构），或对现有多肽的亲和力优化。

2. 序列进化与机器学习：基于大数据的预测

核心原理：利用同源蛋白的保守序列（如天然配体的结合 motif）或已报道的活性多肽序列，通过机器学习（如随机森林、深度学习）构建预测模型，筛选潜在活性序列。典型应用：

基于数据库（如 PeptideDB、UniProt）中已有的 PD-1 结合肽序列，训练模型预测新的结合肽，准确率可达 70% 以上；

通过序列比对分析肿瘤抗原表位的保守区域，设计能被 T 细胞识别的肿瘤疫苗肽。优势：依赖现有数据，无需靶标结构，适合结构未知但有大量序列数据的靶点。劣势：预测结果需实验验证，避免因数据偏差导致的假阳性。适用场景：同源性高的靶标家族（如细胞因子受体、蛋白酶）、或基于已知活性肽的序列优化。

总结：筛选方法的选择逻辑

选择靶向多肽探针的筛选方法，需围绕 “靶标特性 - 研发阶段 - 性能需求” 综合判断：

靶标定位：胞外可溶性蛋白→噬菌体展示；膜蛋白→细胞亲和筛选；胞内靶点→mRNA 展示 / 核糖体展示；

研发阶段：初筛（海量序列）→mRNA 展示 / 噬菌体展示；功能验证→细胞功能筛选；亲和力优化→分子对接；

性能需求：需非天然氨基酸→mRNA 展示；需快速验证→计算生物学筛选；需临床级活性→功能导向筛选。

随着技术融合（如 “计算预测 + 体外验证” 的组合策略），靶向多肽的筛选效率与活性将进一步提升，为精准诊疗、靶向递送等领域提供更高效的分子工具。