荧光原位杂交（FISH）虽然已成为诸多学科必要掌握的一门实验技术，但大家还是会在开展实验过程中遇到各种各样的问题，今天就把几个注意要点和问题给大家讲解一下：

1.荧光标记探针的长度和浓度分别为多少合适？

标记探针的长度不宜过大，以150-350bp/nt为宜，片段过长易导致非特异杂交；片段短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短，但片段过短往往会降低检测灵敏度。

最适宜的探针浓度通常需通过实验才能确定，其在杂交工作液中的浓度范围一般为0.25-1μg/mL，研究者可以按照0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL来进行优化。

2.生物素标记探针能否进行荧光原位杂交？

完全可以！研究者可先使用生物素标记探针进行杂交，而后再进一步使用亲和素标记荧光素孵育，让探针加上荧光标记，进而就可直接通过荧光显微镜进行观察啦！

这种方式不仅可以将杂交信号二次放大，具备更高的检测灵敏度，而且当检测多个基因时，该种方法也更灵活，因为亲和素标记的荧光素种类比能直接标记到探针上的荧光素种类要更多，研究者可拥有更多的选择性！目前，市场上做该类型FISH实验的试剂盒品牌只在极少数，研究者可优先选择像百代生物这样的龙头企业品牌，产品性能更有保证，并且使用该试剂盒，研究者可省去繁琐的预杂交步骤，实验流程更简便的同时实验效率也能得到显著提升。

3.如何提高荧光原位杂交实验的成功率？

有几点值得注意的方面，关注起来就可以帮助提高实验成功率哦~

（1）探针

探针是实验的核心，其设计合成至关重要。需使用特异性高、信号强的商业化探针或自制探针，确保探针序列与靶序列互补，且无重复序列干扰。研究者可选择知名品牌如Roche或BIOG的荧光标记探针合成试剂盒自行设计合成，其中反应体系经反复优化，可使标记核苷酸最大程度的掺入到探针中，使探针活性增强从而提高检测灵敏度；也可找经验丰富的探针合成公司（如百代生物等）定制化设计合成专业的商业化探针产品。

（2）样本制备与固定

样本质量是成功的基石，决定了后续所有步骤的上限。

尽量使用新鲜的细胞或组织样本。对于RNA FISH，操作需更加迅速并使用RNase-free的试剂和耗材，以防止降解RNA。此外，选择适当的固定剂（如多聚甲醛）并优化固定时间。固定不足会导致核酸降解和形态破坏；固定过度会降低通透效率，掩盖靶点。关键是要保持细胞形态的同时，最大限度地暴露靶核酸。

（3）通透液

通透的目的是让探针能够进入细胞核与靶DNA/RNA结合。通透不足，探针进不去；通透过度，则会破坏细胞形态和靶位点结构。可以选择像BIOG这类的通透液，其中特别添加了通透因子，不仅能帮助在细胞膜上进行高效打孔，使探针更容易进入，而且还可有效避免对胞浆胞核造成损坏，大大提高了原位杂交实验的成功率。

（4）杂交液

杂交液为探针与靶序列的结合提供环境。像Roche、BIOG的亲和杂交液经过反复优化，不仅能促进特异性杂交，充分封闭组织细胞中探针的非特异结合位点（阻断非特异性结合），还特别添加了稳定剂成分，能将探针分子“困”在局部区域，有效增加探针的相对浓度，从而大大加速杂交反应速率，更能使杂交体保持稳定，从而提高实验成功率！

（5）设置对照

在FISH实验中，设置对照是客观解读结果、排除假象的关键环节。阳性对照主要用于来验证整个实验流程的操作准确性，阴性对照主要用于确认观察到的信号是特异的，而非背景或非特异性结合造成的。只有在阳性对照有强信号、阴性对照无信号的前提下，目标样本的FISH结果才是可靠、可解读的。忽略对照设置，得到的任何“阳性”或“阴性”结果都可能是误导性的。