双特异性抗体（BsAb）的 “双重靶向” 功能，需依托可靠的制备方法才能落地 —— 从早期的化学偶联到如今的基因工程，制备技术的迭代直接决定了双抗的活性、纯度与产业化潜力。目前主流的 3 类制备方法（化学偶联法、双杂交瘤融合法、基因工程法）各有适配场景，其中基因工程法因能解决 “链错配”“产物不均一” 等核心痛点，成为临床级双抗生产的绝对主力。本文将系统拆解每种方法的原理、优劣势及应用边界，为双抗研发的技术选择提供参考。
一、化学偶联法：快速但 “粗糙” 的早期方案化学偶联法是最早用于制备双抗的技术，核心逻辑是通过化学交联剂将两个独立的抗体或抗体片段（如 Fab、scFv）连接，形成具有双靶向能力的分子。
1. 原理与操作该方法无需基因改造，流程简单：先通过蛋白酶水解（如木瓜蛋白酶水解 IgG 获得 Fab 片段）或直接使用完整 IgG，再选择合适的交联剂（如戊二醛、SMCC、SPDP 等），利用交联剂两端的活性基团（如氨基、巯基反应基团），将两个不同抗体的氨基酸残基（如赖氨酸的氨基、半胱氨酸的巯基）共价连接。例如，使用 SMCC（琥珀酰亚胺 - 4-(N - 马来酰亚胺甲基) 环己烷 - 1 - 羧酸酯）可特异性连接含巯基的 Fab 片段与含氨基的另一种抗体，形成双抗。
2. 优劣势对比优势：操作便捷、周期短（1-2 周可获得产物），无需复杂的基因克隆或细胞培养技术，适合科研场景下的 “快速验证”（如验证双靶点协同作用的可行性）。
致命缺陷：
破坏抗原结合活性：交联剂可能随机结合抗体的抗原结合区（CDR 区），导致 30%-50% 的抗体活性丧失，且无法精准控制连接位点；
安全风险：部分交联剂（如戊二醛）具有细胞毒性或潜在致癌性，即使残留量极低，也不符合临床级药物的安全性要求；
产物不均一：交联反应易形成 “多聚体”（如两个以上抗体连接）或 “错配产物”（同一抗体自身交联），需通过复杂纯化（如 SEC-HPLC）分离，最终双抗得率通常低于 20%。
3. 应用场景仅适用于实验室小试（如双抗作用机制的初步验证），无法满足临床级双抗对 “高活性、高纯度、无毒性残留” 的要求，目前已基本退出临床双抗的制备体系。
二、双杂交瘤融合法：天然但 “低效” 的细胞工程方案双杂交瘤融合法基于传统单克隆抗体制备技术，通过细胞融合获得能同时分泌两种抗体轻链、重链的杂交瘤细胞，进而组装成双抗，核心是模拟 “天然抗体表达” 过程。
1. 原理与流程该方法需两步融合：第一步，分别用两种靶抗原免疫小鼠，制备能分泌对应单抗的杂交瘤细胞（如抗 CD19 杂交瘤、抗 CD3 杂交瘤）；第二步，使用聚乙二醇（PEG）或电穿孔技术，将两种杂交瘤细胞融合，获得 “四源杂交瘤细胞”（含两种杂交瘤的基因组）；最后通过有限稀释法筛选，鉴定能分泌 “正确双抗”（同时结合两种抗原）的细胞克隆。
2. 优劣势对比优势：
抗体活性天然：细胞天然表达的抗体可正确折叠（形成二级、三级结构），并进行生理性翻译后修饰（如糖基化），生物活性接近天然抗体；
结构稳定：无需外源基因改造，抗体的轻重链组装依赖细胞自身的质控系统，不易形成聚集体。
核心局限：
链错配率极高：两种杂交瘤细胞会分泌 2 种重链（H1、H2）和 2 种轻链（L1、L2），理论上可形成 9 种组合（如 H1L1、H1L2、H2L1、H2L2、H1H2L1、H1H2L2 等），其中 “正确双抗”（H1L1+H2L2 组装）的比例通常低于 10%，筛选难度极大；
产量低且不稳定：四源杂交瘤细胞的遗传稳定性差，传代过程中易丢失抗体基因，导致双抗表达量逐渐下降（从初始 100μg/mL 降至 20μg/mL 以下）；
人源化难：该方法依赖小鼠杂交瘤细胞，后续需通过复杂的人源化改造降低免疫原性，周期长达 6-12 个月。
3. 应用场景仅在早期双抗研究中使用（如 1983 年首个双抗的制备），目前已被基因工程法取代，仅少数科研团队用于 “天然双抗序列挖掘”（如从杂交瘤细胞中克隆抗体基因）。
三、基因工程法：精准且 “可产业化” 的主流方案基因工程法通过DNA 重组技术直接设计、构建双抗的基因序列，转染至宿主细胞后定向表达，从源头解决了 “链错配”“产物不均一” 的问题，是目前临床级双抗制备的唯一选择（全球已上市的 18 款双抗中，16 款采用此方法）。
1. 核心原理该方法的关键是 “基因层面的精准控制”：先克隆两种亲本抗体的轻链（VL）、重链（VH）基因，通过基因编辑技术（如酶切连接、无缝克隆）构建双抗表达载体，在载体中设计 “链配对控制元件”（避免错配）；再将载体转染至合适的宿主细胞（如 CHO、HEK293、大肠杆菌），通过细胞培养实现双抗的可溶性表达，最后经纯化获得高纯度产物。
2. 关键技术：解决 “链错配” 的核心手段链错配是双抗制备的最大技术瓶颈，基因工程法通过以下 3 类成熟技术实现精准配对：
重链错配解决方案（Knob-in-Hole，旋钮 - 孔技术）：在一种重链的 CH3 结构域引入 “旋钮”（大体积氨基酸，如酪氨酸 Y），在另一种重链的 CH3 结构域引入 “孔”（小体积氨基酸，如苏氨酸 T），通过空间互补作用促进两种重链正确二聚化，错配率可降至 5% 以下；
轻重链错配解决方案（CrossMab 技术）：通过基因片段交换，将一种重链的 CH1 域与轻链的 CL 域交换（或重链 VH 与轻链 VL 交换），使特定重链仅能与对应的轻链结合，彻底避免轻重链错配；
单链双抗构建（如 BiTE 技术）：将两个 scFv（抗靶抗原 scFv + 抗 CD3 scFv）通过柔性 linker 串联，构建成单条肽链，无需轻重链组装，从根本上消除错配问题，适合制备非 IgG 样双抗（如 blinatumomab）。
3. 宿主细胞选择：适配不同双抗结构基因工程法可根据双抗结构选择对应的宿主细胞，兼顾表达量与修饰需求：
CHO 细胞：适合制备 IgG 样双抗（需 Fc 段糖基化），表达量可达 3-8g/L，且能模拟人类糖基化模式，降低免疫原性，是临床级全长双抗的首选；
HEK293 细胞：适合瞬转表达（7-10 天获得产物），转染效率高（可达 80%），适合双抗候选分子的快速筛选；
大肠杆菌：适合制备非 IgG 样双抗（如 scFv、VHH 组合双抗），生长快、成本低，可溶性表达率可达 60%-80%，适合工业化大规模生产。
4. 优劣势对比优势：
产物均一性高：通过链配对控制技术，正确双抗比例可达 90% 以上，无需复杂纯化；
可定制化改造：可灵活引入 Fc 段突变（如增强 ADCC、延长半衰期）、细胞穿透肽（提升实体瘤穿透性）等，拓展双抗功能；
产业化潜力大：可构建稳定表达细胞株（CHO 稳转株），在万升生物反应器中实现公斤级生产，批次间差异 < 5%，满足临床用药需求。
唯一挑战：技术门槛较高，需掌握基因克隆、载体构建、细胞培养等全流程技术，且前期研发周期较长（3-6 个月）。
四、制备方法的选择逻辑：从需求匹配到技术适配双抗制备方法的选择，本质是 “应用场景与技术特性” 的匹配：
科研小试（快速验证机制）：优先选择化学偶联法（1-2 周出结果），或 HEK293 细胞瞬转的基因工程法（2-3 周）；
临床前开发（需高活性、低免疫原性）：必须选择基因工程法，且优先用 CHO 细胞表达（模拟人类糖基化）；
工业化生产（需高产量、高一致性）：仅能选择 CHO 细胞稳转的基因工程法，通过流加培养工艺实现规模化生产。
总结双特异性抗体的制备技术已从 “早期探索” 进入 “精准可控” 的阶段 —— 化学偶联法与双杂交瘤融合法因先天缺陷逐渐边缘化，基因工程法凭借 “精准配对、可定制化、可产业化” 的优势，成为支撑双抗临床转化的核心技术。随着基因编辑技术（如 CRISPR）、AI 辅助设计的融入，基因工程法将进一步提升双抗的表达效率与功能多样性，推动更多双抗药物走向临床。
