上一期我们讲了酵母双杂交的核心原理，这一期就进入 “实战环节”—— 从感受态制备、转化操作，到对照设置、结果解读，再到常见问题的解决方案，甚至附上实际应用案例，手把手带新手吃透酵母双杂交实验，再也不怕做不出结果或解读错数据。
一、先分清两个核心体系：核体系 vs 膜体系实验前先明确研究对象：若研究核蛋白互作，用核体系；若研究膜蛋白互作（如受体 - 配体），用膜体系，两者原理不同但操作逻辑相通：
核体系：诱饵蛋白（X-BD）与猎物蛋白（Y-AD）互作→BD 与 AD 靠近→激活下游 His、Ade 等报告基因→酵母在缺对应营养的培养基上生长；
膜体系：诱饵（X-Cub-TF）与猎物（Y-NubG）互作→泛素片段（Cub+NubG）重组→TF 被剪切进入细胞核→激活报告基因，避免膜蛋白进入细胞核的难题。
二、核心实操：感受态制备 + 转化，关键细节别踩坑1. 酵母感受态制备（经费有限版，商用感受态直接跳过此步）感受态质量直接影响转化效率，步骤和细节缺一不可：
从 - 80℃取出酵母菌株（如 Y2HGold、AH109），涂布 YPDA 平板，28℃倒置培养 4-7 天，长出单克隆；
挑取单个克隆接入 10mL YPDA 液体培养基，30℃、250rpm 震荡培养至 OD₆₀₀=1.4-1.8，再扩大培养至 50-100mL，直至 OD₆₀₀=0.6-0.8（重点：OD 值过高会导致感受态活性下降）；
1000g 室温离心 5min 收集细胞，弃上清；
加 50mL 无菌超纯水重悬洗涤，1000g 离心 5min，重复 1 次（去除培养基残留）；
加 3mL 1.1×TE/LiAc 重悬，等体积分装到新管，6000g 离心 30s，弃上清；
加适量 1.1×TE/LiAc 重悬，100μL / 管分装，-80℃保存（重点：避免反复冻融，影响活性）。
2. 酵母转化（核体系为例）转化步骤虽简单，但细节决定成败：
取出感受态，室温解冻，加入 10μL ssDNA（作用：类似 “保护剂”，避免质粒被酵母核酸酶降解）、0.1μg 质粒（诱饵 + 猎物载体）、600μL PEG/LiAc，涡旋混匀（重点：PEG/LiAc 需现配，浓度不对会影响转化效率）；
30℃水浴 30min（让质粒进入细胞），加入 70μL DMSO（增强细胞膜通透性），42℃热激 15min（关键：热激温度和时间不能错，否则细胞死亡）；
冰上冷却 2min，2000g 离心 10s，弃上清，加 1mL 无菌水重悬；
取 200μL 涂到对应营养缺陷型平板（如二缺板），28℃倒置培养 2-4 天，观察菌落。
三、对照设置 + 结果解读：这步错了，实验白做！酵母双杂交的核心是 “通过对照排除假阳性 / 假阴性”，必须设置 4 组关键对照，搭配不同培养基判断结果：
1. 必设对照组（核体系为例）对照组质粒组合目的阴性对照pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT排除非特异性互作（Lam 与 ADT 无互作）阳性对照pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT验证系统有效性（P53 与 ADT 已知互作）自激活组pGBKT7-X + pGADT7检测诱饵蛋白 X 是否单独激活报告基因实验组pGBKT7-X + pGADT7-Y验证 X 与 Y 是否互作2. 培养基与结果判断二缺板（SD/-Trp/-Leu）：所有组都长菌落→证明两种质粒均成功转入酵母（转化没问题）；若某组不长→转化失败，需重新做；
三缺板（SD/-Trp/-Leu/-His）：阳性对照长、阴性对照不长、自激活组不长→系统正常；实验组长→初步判断 X 与 Y 互作；
四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：阳性对照长、实验组长→确认 X 与 Y 互作（四缺筛选更严格，减少假阳性）；若自激活组长→需用 AbA（金担子素）或 3-AT 抑制自激活；
X-gal 显色：阳性菌落因表达 LacZ 基因，会将 X-gal 切成深蓝色产物→进一步验证互作（非必需，但可增强结果可信度）。
四、常见问题排坑：这些错误新手最常犯！1. 培养基问题：变色、凝固差原因：SD 培养基含葡萄糖，高温灭菌易碳化（颜色变深）；琼脂用量不足或 pH 不对导致凝固差；
解决：用 SC 培养基（不含葡萄糖），灭菌后无菌添加葡萄糖；调整琼脂用量（通常 2%），灭菌前调 pH 至 5.8。
2. 酵母生长问题：生长慢、变粉色原因：培养基试剂过期 / 用量不足（营养不够）；腺嘌呤浓度低（酵母变粉色）；诱饵蛋白有毒性；
解决：检查试剂有效期，按配方准确称量；补充腺嘌呤；若蛋白有毒性，换低拷贝载体表达诱饵。
3. 假阳性问题：筛选到的克隆太多原因：诱饵蛋白自激活；转化浓度过高；筛选不够严格；
解决：用四缺板 + AbA（100-200ng/mL）或 3-AT（10-20mM）增强筛选严格性；降低涂板浓度；截短诱饵蛋白的转录激活结构域。
五、应用案例：酵母双杂交不只是 “验证互作”验证核蛋白互作：研究 UBE2S 与 AKIP1 的互作，阳性对照（P53-ADT）在三缺 / 四缺板长菌落，实验组（AKIP1-UBE2S）也长，结合 Co-IP 实验，确认两者互作；
验证膜蛋白互作：用膜体系验证 KDELR 与 EGFR 的互作，阳性对照（KDELR-ACBD3）长菌落，实验组（KDELR-EGFR）长，阴性对照（KDELR-GLUT4）不长，证明膜蛋白互作；
筛选小分子抑制剂：针对结核分枝杆菌的 FtsZ-SepF 互作，建立酵母双杂交系统，筛选到化合物 T0349，能抑制两者互作，且低毒性，为抗结核药物研发提供靶点。
