一、研究背景
人工骨材料在骨折修复中起着至关重要的作用，要求材料具有易于加工、生物相容性高、可生物降解等特性。目前，人工骨材料主要有三类：金属（合金）、陶瓷和聚合物。金属人工骨具有良好的可加工性、高强度和高韧性。然而，它们的弹性模量远大于人体骨骼，由于应力屏蔽可能导致手术失败。相反，氧化铝、氧化锆、生物活性玻璃、羟基磷灰石和磷酸三钙等陶瓷材料显示出高强度，但通常具有明显的脆性和较差的韧性。聚合物，包括聚乳酸，具有广泛可调的力学性能和生物降解性，成为骨组织工程应用前景广阔的候选者。尽管有这些优点，聚合物人工骨在加工成刚性螺钉方面经常面临挑战，限制了其在骨组织植入、固定和附着方面的功效。
蚕丝作为一种天然的蛋白质高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性、可加工性和低成本，广泛应用于外科缝线、人造皮肤、肌肉、血管和骨骼等生物医学领域。值得注意的是，蚕丝的杨氏模量为8.9-17.4GPa，密度为1.3-1.4g/cm3。与人体骨骼的值相似，通常3-20GPa和1.8-2.0 g/cm3。与金属或陶瓷植入物相比，蚕丝是人工骨材料的潜在替代品。由再生丝素蛋白粉制成的螺钉具有良好的力学性能、生物相容性和生物降解性，显示出其作为人工骨的潜力。然而，由纯丝素蛋白制备的人工骨的降解率是通过牺牲其力学性能来调节。因此，有必要在不降低人工骨力学性能的情况下，开发一种可调节生物降解性的人工骨，以满足人体骨的相容性。
二、研究成果
近日，西安工程大学樊威和清华大学张莹莹合作报道了一种由纯丝绸组成的丝织物增强丝材料（SFS），具有优异的生物相容性、成骨性和生物降解性，并显示出其作为骨植入材料的卓越性能。SFS以脱胶丝绸为增强材料，丝素蛋白为基体，通过简单的热压工艺制备。SFS作为一种自增强复合材料，由于基体与增强材料之间近乎完美的界面，具有优异的力学性能。更重要的是，通过调整丝绸织物的比例，SFS的机械性能、生物降解率和密度可根据人体不同部位的骨植入要求进行定制。此外，SFS可以改善成骨细胞的增殖，增加成骨活性，而临床使用的钛合金人工骨并非如此。因此，SFS在医疗骨折修复领域具有取代传统金属或陶瓷植入物的巨大潜力。
相关研究工作以“Silk-Fabric Reinforced Silk for Artificial Bones”为题发表在国际顶级期刊《Advanced Materials》上。
三、研究内容
1、SFS的特性及热成型机理
将RS和脱胶平纹丝绸在模具中逐层堆叠，并热压成SFS（图1a）。脱胶后的丝绸织物（图1b-c）用于增强RS。RS的粒度范围为10 -130μm，大多数分布在50-90μm（图1c-d）。SFS板（图1f）具有良好的可加工性，可加工成任何形状，如螺钉（图1g）、圆柱体（图1h）和表面铭文（图1i）。
图1. SFS的制备和形态
根据TG曲线，RS、丝绸和SFS的含水量分别为7.4%、6.1%和6.6%。RS、丝绸织物和SFS的初始热解温度分别为192.5°C、212.9°C和215.4°C（图2a）。此外，DSC分析表明，RS的水玻璃化转变温度（Tg´）为69.1°C，而在丝织物和SFS中没有观察到Tg´。固定玻璃化转变温度（Tg）为179.3°C（图2b）。结合水在Tg’和Tg之间蒸发，在125.0°C时达到最大蒸发率。
图2c-f显示，由于丝素蛋白二级结构的变化和β-片结构的形成，丝基质从粉末（热压前）转变为大块板（热压后）。图2c中，SFS包含位于1663cm-1处的酰胺I带（β-片）和位于1082cm-1、1228cm-1和1295cm-1的酰胺III带的峰。热压后出现对应于β-转弯的峰。XRD结果显示，在145°C热压的SFS中，丝绸II结构的形成，表明丝绸I向丝绸II结构的转变（图2d）。图2e表明，通过热压，将无规线圈/α-螺旋转变为β-片结构。结晶度可以根据XRD结果的高斯拟合获得，如图2f所示。热压前，RS具有非晶结构，具有高含量的无规线圈/α-螺旋（84.8%）、低含量的β-片（4.6%）和β-匝（10.6%）。热压后，SFS和RS的β-片含量（＞55%）均增加，与丝绸相当。
XPS显示，主要光电子能谱峰位于284.8eV、398.4eV和531.8eV处，分别对应于C1s、N1s和O1s原子轨道（图2g）。C1s XPS光谱表明了不同的官能团：C-C（284.8eV）、C-O/C-N（286.1eV）和C=O（288.0eV）（图2h）。N1s XPS光谱表明N官能团为C-N-C（398.4eV）（图2i）。O1s XPS光谱显示C-O（531.7eV）和C=O（533.0eV）（图2j）。表明SFS中没有形成新的化学键。
基于上述观察，提出了SFS的形成机制。原料RS是无定形的，具有无规卷曲，而丝绸织物的表面结晶度降低，并脱胶过程中无规卷曲增加。在热压过程中，在剪切力和结合水的作用下，粉末和织物、粉末和粉末、织物和织物通过氢键、范德华力和静电力紧密结合在一起，即丝素蛋白分子重排和自组装。在基体和界面区域，这些非共价键将无规线圈转变为β-片结构，导致高度结合和致密的SFS（图2k）。当温度超过Tg’时，丝素蛋白分子链的流动性增强，RS在高压下致密化。当温度接近并低于Tg时，强结合水被去除，且丝素蛋白分子链具有足够的流动性，以形成分子间和分子内的β-片纳米晶体。因此，在丝织物增强物和RS基质形式之间形成了强的界面结合，导致SFS的形成。
图2. SFS的结构表征和分子尺度形成机制示意图
2、SFS的力学性能
图3a-b显示，所有机械强度从RS块体增加到100L SFS，后在165L SFS时降低。由于织物增强，15L、50L和100L SFS的拉伸和弯曲强度明显高于RS块体。165L SFS的机械性能下降是由相邻织物层之间不存在RS作为基质引起的。SFS的最大拉伸、弯曲、压缩和剪切强度分别比报道的热压丝体高21.7%、47.4%和166.9%。此外，SFS的韧性随着织物体积含量的增加而增加，在1.0-12.8MJ/cm3内（图3c），与皮质骨的韧性（2-12MJ/cm3）接近。SFS的密度范围为1.3-1.7g/cm3，其中100L SFS密度为1.5g/cm3，与人类皮质骨的密度（1.8-2.0g/cm3）相似。相比之下，TC4钛合金是当今最常用的人造骨材料，其力学性能和密度（4.5g/cm3）远大于人类皮质骨，通常会产生应力屏蔽效应（图3d）。
图3e-f中，SFS的丝纤维、界面和基体的硬度测量值分别为27.8μN/nm、23.7μN/nm和21.8μN/nm。在静电力调制模式下，AFM的电压间接反映了丝纤维、界面和SFS基体的刚度（图3h）。值得注意的是，纤维和基体之间的界面处的电压值呈梯度下降（图3i），表明从纤维到基体的刚度逐渐下降，而不是界面处急剧下降。梯度界面层有助于将应力从基体转移到增强纤维，并进一步提高复合材料的力学性能，解释了SFS优异的力学性能。
图3. SFS的力学性能
为了进一步证实上述论点，通过有限元模型对SFS的拉伸性能进行了分析。应用RVE模型的周期边界条件（PBC）模拟了100L SFS的拉伸过程（图4a）。图4b显示，无界面有限元的抗拉强度（120.52MPa）比实验的抗拉强度114.81MPa大5.0%。具有界面（101.28MPa）的100L SFS的抗拉强度比实验值低11.8%。这意味着较弱的界面结合性能会降低SFS的机械性能。此外，图4c和4d表明，界面的存在可能会影响SFS的渐进损伤过程。根据SFS拉伸破坏的SEM图，SFS的破坏主要由基体开裂（图4e）和纤维断裂（图4f）组成，与有限元模拟基本一致。拉伸失效后，断裂的纤维仍然与基体紧密结合（图4g）。上述分析证明了SFS的丝纤维和丝基质之间存在几乎完美的界面。
图4. SFS力学性能的有限元分析
3、SFS的生物降解性和生物相容性
在SFS的体内植入实验之前，先对SFS、RS块体和TC4钛合金进行体外细胞成骨实验，以比较这三种材料对细胞粘附、增殖和分化的影响，如图5所示。细胞粘附在所有三个支架的表面（图5a-c），表明100L SFS和RS块体上的细胞伪足数量显著增加，伪足变得更加细长并交织成网状。图5d-i显示，粘附在100L SFS、RS块体和TC4钛合金上的MC3T3-E1细胞数量从1h增加到3h（图5d-i）。同时，培养5h的MC3T3-E1细胞粘附在100L SFS上的数量最多，其次是RS块体，粘附在TC4钛合金上的细胞数量最少，差异具有统计学意义（*p<0.05）（图5p）。这是由于它们的亲水性不同（100L SFS、RS块体和TC4钛合金的水接触角分别为49°、66°和107°），亲水性越好，更有利于细胞粘附。因此，100L SFS更有利于成骨细胞粘附，且粘附状态优于RS块体。从图5j-o可以看出，100L SFS和RS块体中的细胞存活率和细胞存活数显著高于TC4钛合金。MC3T3-E1细胞在100L SFS支架上的ALP活性显著高于TC4钛合金和对照组（*p<0.05）（图5q）。在第28天，沉积在100L SFS支架上的钙盐量也显著高于RS块体、TC4钛合金和对照组（图5r）。与100L SFS共培养的MC3T3-E1细胞中ALP（图5s）、OCN（图5t）和RUNX2（图5u）的表达显著高于其他三组（*p<0.05），表明SFS具有良好的促成骨分化作用。这些结果证实，100L SFS更有利于促进成骨分化。
图5. SFS的体外成骨特性
接着，进行了体外降解实验，以证明SFS在人体组织液中的生物降解性。结果表明，SFS的降解速率可以通过调节丝绸织物的层数来调节。30天后体外降解的残留物质量比为RS块体>100L>50L>15L>165L SFS（图6a-c）。随着织物含量的增加，形成了多个界面，降解溶液沿着界面通道进入SFS，导致降解加速（图6d）。
考虑到力学性能和体外降解性，对100L SFS进行了体内生物相容性测试。SFS被加工成长10mm、直径4mm的指甲形状。然后，将其植入新西兰兔的股骨远端（图6e-f）。显微CT成像显示，SFS钉在四周后在股骨内保持完整（图6g）。图6h，6i显示，SFS周围有许多多核细胞和巨噬细胞，表明在没有炎症的情况下形成了新的骨结构。植入SFS的兔子在7天和30天后测量的参数在健康范围内，表明该材料的无毒性和生物相容性。
图6. SFS的体外生物降解和体内生物相容性
四、结论与展望
这项研究证明了具有嵌入丝绸织物层的RS可通过热压方法，转化为紧凑且高度结晶的SFS。天然丝纤维是具有稳定的丝绸II结构的半结晶材料，相对稳定地承受外部环境的影响。相比之下，RS是一种主要由丝绸I结构组成的无定形物质，可在高温高压下转化为稳定的丝绸II结构。丝素蛋白分子可以通过氢键、范德华力和静电力和丝织物重新排列、组装并紧密结合。由于基体和增强体都是丝，SFS内的界面表现出稳定性和强度，有助于将应力从基体转移到织物上，从而产生具有优异机械性能的SFS。更重要的是，SFS的机械性能、生物降解率和密度可通过设计增强结构（如使用3D编织物、3D机织物、三维缝合物和3D针刺物）或调整增强物和基质的比例来定制，以符合人体不同部位的骨植入。
SFS的性能比其他人工骨更接近人类骨骼，其克服了金属和合金人工骨的应力屏蔽效应以及陶瓷人工骨的脆性的缺点。此外，SFS可以改善成骨细胞的增殖，并且可以在骨愈合时在体内逐渐降解，而不需要通过二次手术去除，而临床上常用的钛合金人工骨并不具备这些品质。因此，由天然丝制成的SFS以简单、可持续的制备方法，以及优异且可调的机械和生物性能，可能在骨组织工程等医学领域发挥重要作用。
文献链接：
https://doi.org/10.1002/adma.202308748
