研究背景
尽管饮酒因其社交和放松效果而广受欢迎，但饮酒始终对公众健康构成重大威胁。事实上，仅在2016年，有害饮酒就导致近300万人死亡，1.326亿残疾调整寿命损失。然而，现有的治疗方法主要依靠内源性酶，只能暂时缓解恶心和头痛等症状，但无法解决其他诸如嗜睡、疲惫和慢性酒精中毒等潜在问题。构建一种有效的解药以减少酒精流行对全球健康的影响，是一项具有挑战性的任务。尽管在静脉应用天然酶复合物时观察到了积极的酒精代谢效果，但受限于其活性不足和使用复杂性，往往会导致有毒乙醛的积累，这引起了重要的临床问题。因此，开发一种稳定口服策略的显得尤为迫切。
研究成果
鉴于此，瑞士苏黎世联邦理工学院Raffaele Mezzenga和Jiaqi Su提出了一种有效的酒精解毒解决方案，即通过利用仿生纳米酶淀粉样蛋白水凝胶作为口服催化平台。选取了富含配位氮原子的β-乳球蛋白的淀粉样纤维作为纳米载体，以稳定原子分散的铁元素。通过模拟辣根过氧化物酶的配位结构，单位点铁纳米酶证明了选择性催化醇氧化为乙酸的能力，而不是毒性更强的乙醛。对患有酒精中毒的小鼠施用凝胶状纳米酶，可显著降低其血液酒精水平（在酒精摄入300min后, 降低55.8%），而不会引起额外的乙醛积聚。此外，这种水凝胶还可以增强肝脏保护，显著减轻与慢性饮酒相关的肠道损伤和微生态失调。通过采用原子级设计和利用纳米酶的能力，这项研究为开发高效、靶向的酒精解毒剂提供了有希望的见解，对肝脏保护和胃肠道健康都有潜在的益处。相关研究工作以“Single-site iron-anchored amyloid hydrogels as catalytic platforms for alcohol detoxification”为题发表在国际顶级期刊《Nature Nanotechnology》上。
研究内容
1、单点铁锚定的β-乳球蛋白原纤维的合成
与使用无机载体的传统方法不同，这项研究利用一种易于获取的蛋白质材料——β-乳球蛋白（BLG）淀粉样纤维，作为原子级分散铁的支撑框架。除了对包括铁在内的各种金属离子的固有结合亲和力外，蛋白质丝的大长径比和β-片层结构的粘附性进一步增强了潜在结合位点的可及性，从而促进了铁原子的高密度负载。并且，BLG原纤维是一种可轻松从天然BLG中提取的乳蛋白，最近通过全面的体外和体内评估证明了其营养成分是安全的，符合潜在的口服给药要求。此外，BLG原纤维的特殊胶凝特性使水凝胶易于生产，其高粘弹性预计会延缓消化过程，从而延长在胃肠道内的作用时间。
通过直接的润湿浸渍程序，将BLG原纤维在乙醇和聚乙二醇200（PEG200）的混合分散体暴露于Fe(NO3)3 PEG200溶液中，合成了单点铁锚定的BLG原纤维(FeSA@FibBLG)催化剂（图1a）。在这个过程中，BLG原纤维中自然存在的氮与铁离子配位，形成功能性的Fe-N-C活性位点。采用多种分析手段，对合成FeSA@FibBLG进行表征。FeSA@FibBLG的形态保留了与纯BLG原纤维一致的纳米级直径，表明铁的整合对结构的影响微乎其微（图1b）。铁均匀分散在BLG原纤维骨架上，如Fe K边缘轮廓与BLG原纤的元素组成的显著重叠所证明的（图1c，d）。原子力显微镜（AFM）图像证实了大约3nm的一致高度，验证了结晶铁或氧化物物种的可忽略不计的存在（图1e，f，g）。如图1h所示，存在小于0.2nm的单个亮点清楚地证明了单个铁原子在FeSAFibBLG上的原子分散，表明在合成过程时，铁仅以单位点形式存在于BLG原纤维上。
图1. FeSA@FibBLG的合成和形态表征
2、FeSA@FibBLG的结构分析
图2a显示了FeSA@FibBLG的前边缘位置位于铁箔（金属铁）和Fe2O3的位置之间。与Fe2O3相比，位于较高结合能的白线区域显示出较低的氧化态和不同的配位环境。X射线吸收近边缘光谱（XANES）为识别大分子配合物中铁的局部对称性提供了关键信息。7120eV以下有明显的前边缘特征，表示酞菁铁（II）（FePc）中的亚铁（Fe2+）方形平面配位，而在FeSA@FibBLG中由于与理想正方形平面度的偏差，该特征略微减小。FeSA@FibBLG的XANES光谱（图2a插图）与FePc非常相似，表明铁在FeSA@FibBLG中为带正电的离子态（Feδ+，其中平均δ接近2）。从R空间中的扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）光谱进一步揭示了铁的局部环境，在大约1.4Å处出现的单峰，可归因于铁和较轻原子（主要是氮）之间的反向散射（图2b），这一发现支持FeSA@FibBLG铁位点的原子分散。利用小波变换分析技术，能够将样品与铁箔对照品区分开。通过显示单个最大强度约为4Å-1和1.4Å，表明Fe-N的贡献显著（图2c），铁的配位数估计为4.5（图2d）。然而，与FePc和Fe2O3等参考文献相比，在区分Fe-N和Fe-O配位方面存在挑战，因此强调Fe-O键的潜在存在至关重要。总之，这些发现证实了FeSA@FibBLG中的铁以单位点形式存在，没有任何晶体或氧化物铁金属结构，主要与氮原子配位。
图2. FeSA@FibBLG的原子结构表征
3、FeSA@FibBLG的过氧化物酶样活性
使用TMB作为底物，分析了这些纳米酶的比活性（SA）值。FeSA@FibBLG的SA明显优于其他两种，为95.0U·mg-1，大约是FeSA@BLG (57.3U·mg-1）的1.7倍和FeNP@FibBLG (9.38U·mg-1）的10.1倍（图3a）。稳态动力学分析揭示，FeSA@FibBLG在氧化TMB中具有优异的催化性能，动力学参数显著，包括最大反应速率（Vmax=0.788μM·s-1），转化数（Kcat=21.9min-1），催化效率（Kcat/Km=5.47×108M-1·min-1）和选择性（Km=4×10-2mM）（图3b）。有趣的是，FeSA@FibBLG在H2O2存在下，也表现出显著的催化氧化乙醇和乙醛的能力（图3c-f）。FeSA@FibBLG对乙醇氧化的SA为7.90U·mg-1，显著超过其他两种参考催化剂。动力学参数分析进一步证实了FeSA@FibBLG在乙醇催化方面的卓越催化效率（Kcat/Km=4.11×105M-1·min-1），比FeSA@BLG（Kcat/Km=8.66×104M-1·min-1）提升4.7倍，以及FeNP@FibBLG（Kcat/Km=9.25×103M-1·min-1）增加44.4倍。当乙醇作为底物时，FeSA@FibBLG也表现出最低的Km值，这表明其对乙醇具有极好的亲和力。需要注意的是，FeSA@FibBLG可以直接将乙醇氧化为乙酸，产生唯一副产物为甲酸，而不会产生任何可检测的乙醛中间体，如1H NMR所证明的（图3d插图）。
图3. 单点铁锚定的BLG原纤维的过氧化物酶样活性
4、急性酒精中毒的保护潜力
由于蛋白质原纤维在吸收了大量酒精的胃肠道中，短暂停留并大部分被消化（通常在4h内）。采用了盐诱导方法，制造了附着AuNP的FeSA@FibBLG淀粉样蛋白水凝胶(简称FeSA@AH)，以实现在胃肠道内的长期滞留，从而增强乙醇氧化的整体能力。FeSA@AH显示出典型的自立能力、明显的纳米纤维结构（在偏振光下异常的双折射）和良好的可注射性（图4a）。随后，使用[18F]氟-2-脱氧葡萄糖（[18F]FDG）标记FeSA@AH，并通过微正电子发射断层扫描（PET）-计算机断层扫描（CT）技术，观察其在C57BL/6小鼠中的运输。结果显示，FeSA@AH的体内滞留时间超过了6h，表明由于化合物的水凝胶性质，在体内的滞留时间延长。
FeSA@AH的预防益处，在酒精处理的小鼠模型中进行了测试（图4c）。一组不含乙醇但PBS灌胃的小鼠作为阴性对照；所有接受乙醇灌胃的小鼠均出现酒精中毒后的嗜睡现象。相较于其他醉酒组，接受了FeSA@AH处理的小鼠明显更早地苏醒（～2h）（图4d）。然后， 在小鼠饮酒后6h进行了Morris水迷宫（MWM）测试，以定量评估其空间参考记忆能力（图4e）。酒精暴露组小鼠的游泳速度与空白组相当，表明其基本活动已恢复。然而，在寻找隐藏平台时，PBS和AH处理的小鼠花费了更多时间和距离，而FeSA@AH组则表现出显著提高的导航效率（图4f，g）。
从病因上讲，行为异常归因于酒精及其体内中间代谢产物乙醛，而肝脏在乙醇代谢中起着核心作用。预防性给予FeSA@AH后，小鼠血液中酒精（BA）浓度得到了立即且持续的显著降低（图4h）。在灌胃后30、60、120、180和300min后，FeSA@AH小鼠的BA浓度分别降低了41.3%、40.4%、42.0%、46.6%和55.8%。重要的是，上述过程并未在血液中引发额外的乙醛（BAce）积累（图4i），这对于保护肝脏至关重要，因为乙醛的积累是肝硬化和肝细胞癌的主要诱因。此外，FeSA@AH组小鼠的肝应激反应明显减轻，表现为血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平显著降低（图4j）。
图4. FeSA@AH作为急性酒精中毒的预防药物的效果
5、慢性酒精中毒的预防作用
NIAAA模型（慢性和狂饮乙醇喂养的小鼠模型）证实FeSA@AH的有益影响。在模型构建后（图5a），与空白相比，PBS小鼠的体重显著降低，肝损伤（气球变性和多灶性炎症细胞浸润）和肝脏脂质积聚增加（图5b，c）。FeSA@AH处理小鼠的体重减轻显著，肝脏损伤明显减轻，肝脏脂质代谢重新调节（图5b，c）。此外，FeSA@AH处理组的小鼠具有比PBS和AH更低的BA。值得注意的是，FeSA@AH还降低了BAce浓度，表明其在乙醇消除内源性ADH中的主要竞争作用。此外，血液中ALT和AST水平显著降低，进一步证实了FeSA@AH对肝脏功能的保护作用（图5d）。
图5. FeSA@AH作为慢性酒精中毒的预防药物的效果
结论与展望
综上所述，研究者设计了一种基于单点铁锚定的淀粉样蛋白水凝胶（FeSA@AH），其对酒精具有显著的催化氧化能力，是体内酒精代谢的高效催化平台。这项工作为基于仿生纳米酶的水凝胶作为口服酒精中毒解药的可行性提供了令人信服的证据。FeSA@AH显示出对乙酸生产的特殊偏好，能够快速降低血液中的酒精水平，同时降低乙醛过量积累的风险，其效果远超现有的依赖天然酶组合的酒精解毒剂。与依赖肝脏进行酒精代谢的传统途径不同，口服FeSA@AH将这一过程转移至胃肠道，不仅减轻了肝脏的负担，还提高了安全性。此外，尽管酒精代谢部位发生了这种变化，但并未出现额外的不良胃肠道症状；相反，FeSA@AH显示出对饮酒引起的肠道损伤和微生态失调的显著缓解，进一步证明了其临床转化的巨大潜力。这项研究概述了合成一种口服仿生纳米酶的通用有效策略，并为未来旨在最大限度地发挥人工酶设计在不同治疗应用中的潜力的研究奠定了基础。
文献链接：
https://www.nature.com/articles/s41565-024-01657-7
